Gen klonlash - bu bitta genning nusxalarini yoki klonlarini yaratish aktidir. Bir gen aniqlangandan keyin, klonlar biomedikal va sanoat tadqiqotlarning ko'plab sohalarida qo'llanilishi mumkin. Genetika muhandisligi genlarni yangi organizmalarga klonlash yoki oqsil mahsulotini o'zgartirish uchun DNK ketma-ketligini o'zgartirish jarayonidir. Genetika muhandislik quyidagi asosiy tartiblarni bajarish qobiliyatiga bog'liq.
01 Polimeraza zanjiri reaktsiyasi
02 cheklash enzimleri
Rezektsiya endonuktazalari deb ataladigan fermentlarning kashf qilinishi proteinlar bo'yicha muhandislik uchun juda zarur edi. Ushbu fermentlar nukleotid sekansına asoslangan aniq joylarda DNKni kesdi. DNKni aniq bir joyda kesishga qodir bo'lgan yuzlab turli cheklovli fermentlar turli bakteriyalar turlaridan ajratilgan. DNKning cheklash enzimi bilan kesilgani turli o'lchamdagi kichikroq qismlarni ishlab chiqaradi. Ular jel elektroforez yoki kromatografiya yordamida ajratilishi mumkin.
03 Elektroforez
DNKni tasavvur qila olmasak, ya'ni hujayra madaniyatidan tozalovchi DNKni yoki cheklovli fermentlar yordamida kesib tashlashni istamasangiz, ya'ni sizning ekstrakangizda biror narsa bor yoki yo'qligini, uni kesib tashlang. Buning bir usuli - jel elektroforez. Jeller turli maqsadlar uchun, DNKning aniqlanishini ko'rib, DNK qo'shimchalarini va naqshlarni aniqlash uchun ishlatiladi.
04 DNKning ikki qismiga qo'shiling
Genetika tadqiqotida ko'pincha ikki yoki undan ko'p DNKning bir-biriga bog'lanishi, rekombinatsial chok hosil qilishi yoki cheklash fermentlari bilan kesilgan dumaloq ipning yopilishi kerak bo'ladi. DNK ligasi deb ataladigan fermentlar nukleotid zanjirlari orasidagi kovalent aloqalarni hosil qiladi. DNK polimeraz I va polinukleotid kinaz fermentlari, bu jarayonda bo'shliqlarni to'ldirish yoki navbati bilan 5 'uchlarini fosforilash uchun muhimdir.
05 Kichik o'zini o'zi takrorlovchi DNKni tanlash
Bakterial genomning tarkibiy qismi bo'lmagan, lekin o'zini takrorlash qobiliyatiga ega bo'lgan kichik dumaloq DNK parchalari plazmid deb nomlanadi. Plazmidlar mikroorganizmlar orasidagi genlarni o'tkazish uchun ko'pincha vektor sifatida ishlatiladi. Biotexnologiyada, qiziqish geni kuchaytirilgach, gen va plazmid cheklash fermentlari bilan kesiladi, ular birlashtirilgan DNK deb nomlanadigan narsalarni ishlab chiqarish bilan birlashadilar. Virusli (bakteriyofag) DNK ham kosmik, bakteriofag genlarini o'z ichiga olgan rekombinat plazmidlar kabi vektor sifatida ham ishlatilishi mumkin.
06 Xost hujayra ichiga vektorni ko'chirish usuli
Plazmid kabi vektorda genetik materialni yangi konakçı hujayralarga uzatish jarayoni transformatsiya deb ataladi. Ushbu usul xosting hujayralarining atrof-muhit o'zgarishiga duchor bo'lishini talab qiladi, bu esa ularni "vakolatli" yoki vektorga vaqtincha o'tkazadigan qiladi. Elektroporatsiya - bunday texnikadir. Plazmid qanchalik katta bo'lsa, hujayralar tomonidan olinadigan samaradorligi past bo'ladi. Katta DNK segmentlari transdüksiya deb ataladigan usulda bakteriofagiya, retrovirus yoki boshqa virusli vektor yoki kosmid yordamida osonroq klonlanadi. Faj yoki virusli vektor ko'pincha rejenerativ tibbiyotda ishlatiladi, lekin biz istamagan xromosomalarning ayrim qismlarida DNKning kiritilishiga olib keladi, bu esa asoratlarni va hatto saratonni keltirib chiqaradi.
Transgenik organizmlarni tanlash usullari
Barcha hujayralar o'zgarish paytida DNKni qabul qilmaydi. Bunda qiladigan narsalarni aniqlash usullari mavjud. Umuman olganda, plazmidlar antibiotik qarshiligi uchun genlarni o'z ichiga oladi va transgenik hujayralar bu genlarni ifodalash va bu antibiotikni o'z ichiga olgan vositalarda o'sishga qobiliyatiga qarab tanlanishi mumkin. Shu bilan bir qatorda selektsiya usullari x-gal / lacZ tizimi yoki rangli va floresans asosidagi selektivlikni ta'minlovchi yashil floresans oqimi kabi boshqa muxbir proteynlar mavjudligiga bog'liq.