DNKni tartibga solish va kuchaytiruvchi genlar bilan PCR nima qilishi kerak
Polimeraza zanjirli reaktsiyasi ( PCR ) genning bir nechta nusxasini yaratish uchun molekulyar genetik usul bo'lib, u shuningdek gen sequencing jarayonining bir qismidir.
Polimeraza zanjir reaktsiyasi qanday ishlaydi?
Gen nusxalari DNKning namunasi yordamida tayyorlanadi va texnologiya namunadagi genning bitta nusxasidan bir nechta nusxa olish uchun etarlicha yaxshi. Millionlab nusxa ko'chirish uchun genning PCRni kuchaytirish, DNKning o'lchamiga va zaryadiga asoslangan (+ yoki -) asoslangan ingl. Texnikani ishlatib, genlar sekanslarini aniqlash va aniqlash imkonini beradi.
Nazorat qilinadigan sharoitda DNKning kichik qismlari DNK polimerazlari deb nomlanadigan fermentlar tomonidan ishlab chiqariladi va ular "shablon" deb nomlanuvchi DNKning bir bo'lagiga bepul deoksinukleotidlar (dNTP) qo'shadilar. Polimeraz uchun boshlang'ich nuqtasi sifatida "primerlar" deb nomlangan kichikroq DNK parchalari ham qo'llaniladi. Astarlar DNK (oligomerlar) ning kichik qurollardan iborat bo'lib, odatda 15 dan 30 gacha nukleotidlar orasida. Ular amplifikatsiya qilingan genlarning oxirida qisqa DNK sekanslarını bilish yoki taxmin qilish yo'li bilan amalga oshiriladi. PCR davomida, DNK tartiblashtiriladi va ikkilamchi iplar ajralib turadi. Sovutish paytida primer shablonga (tavlanuvchi deb ataladi) bog'lanadi va polimeraza boshlash uchun joy yaratadi.
PCR texnikasi
Polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) termofillarni va termofil polimeraz fermentlarini (yuqori haroratlarda isitilgandan keyin tizimli yaxlitlik va funksionallikni saqlaydigan fermentlar) kashf qilish yo'li bilan amalga oshirildi.
PCR texnikasi bilan bog'liq qadamlar quyidagilar:
- DNK shabloni, polimeraza fermenti, primerler va dNTPlarning optimallashtirilgan konsentratsiyasi bilan aralashma hosil bo'ladi. Enzimni denatürsüz aralashmani isitish qobiliyati 94 daraja Tselsiy bo'yicha haroratda DNK namunasining juft sarmalini denatirovkalash imkonini beradi.
- Quyidagi denatürasyonda namuna 54 daraja atrofida ancha o'rta darajaga qadar soğutulur va bu primerlerin bir iplikçikli DNK şablonlarına tavlanmasını osonlashtiradi.
- Tsiklning uchinchi bosqichida namunadir uzaytirish uchun Taq DNK polimerazasi uchun ideal harorat 72 darajaga qayta isitiladi. Uzaytirish vaqtida DNK polimerazi har bir primerning 3 'uchiga qo'shimcha dNTP qo'shib, qiziqish genining hududida ikki qavatli DNKning bir qismini hosil qilish uchun DNKning asl yagona strandini shablon sifatida ishlatadi.
- To'liq mos kelmaydigan DNK seksiyalariga tavsiflangan primerlar 72 darajagacha tavlanmasdan, shuning uchun qiziqish geniga uzayishni cheklaydi.
Denovatsiya, kavlash va uzayish jarayoni juda ko'p (30-40) marta takrorlanib, aralashmada istalgan genning nusxalari soni oshib boradi. Ushbu jarayon qo'lda bajarilsa juda zerikarli bo'lishiga qaramasdan, ko'plab molekulyar laboratoriyalarda odatiy holga keltirilgan, programlanabilen bir termosikldagi namunalar tayyorlanishi va inkübe qilinishi mumkin va to'liq PCR reaktsiyasi 3-4 soat ichida bajarilishi mumkin.
Har bir denaturing bosqichi oldingi davrning uzayishi jarayonini to'xtatadi, shuning uchun yangi DNK iplarini qisqartiradi va kerakli genning o'lchamini saqlab qoladi.
Uzatma davrining davomiyligi gen geni miqdoriga qarab uzoqroq yoki qisqartirilishi mumkin, biroq oxirida, qayta ishlangan PCR sikllari orqali ko'pchilik shablonlarning o'ziga xos genning o'lchamlari bilan chegaralanadi. har ikkala primer mahsulotidan ishlab chiqariladi.
Natijalarni yaxshilash uchun manipulyatsiya qilingan muvaffaqiyatli PCR uchun bir nechta omillar mavjud . PCR mahsulotining mavjudligini aniqlash uchun eng keng tarqalgan usul - agarozli gel elektroforez . DNK fragmentlarini o'lcham va zaryadga asoslangan holda ajratish uchun ishlatiladi. Parchalar keyinchalik bo'yoqlar yoki radioizotoplar yordamida ko'zdan kechiriladi.
Evolyutsiya
PCRni kashf qilganligi uchun original Taqdan tashqari DNKning polimerazlari aniqlangan. Ulardan ba'zilari yaxshi "reja tuzish" qobiliyatiga ega yoki yuqori haroratlarda yanada barqaror bo'ladi, shuning uchun PCRning o'ziga xosligini oshiradi va noto'g'ri dNTP kiritilishida xatolarni kamaytiradi.
PCR ning ba'zi bir turlari maxsus dasturlar uchun mo'ljallangan va hozirda molekulyar genetik laboratoriyalarda muntazam ravishda foydalanilmoqda. Ulardan ba'zilari Real-Time PCR va Reverse-Transcriptase PCR. PCR ning kashfiyoti DNK sekanslanmasini, DNK barmoq izlarini va boshqa molekulyar texnikani rivojlanishiga olib keldi.