Polimeraza zanjir reaktsiyasi (PCR) reaktsiyasining tarkibiy qismlariga kiritilgan o'zgartirishlar mahsulot sifatini yaxshilash yoki kamaytirish yoki reaktsiyaning o'ziga xosligini va sezuvchanligini oshirish orqali natijaning sifatini o'zgartirishi mumkin. Natijani ta'sir qiluvchi parametrlar jismoniy (ya'ni, harorat, tsikl vaqtlari) yoki kimyoviy (ya'ni, shablon kontsentratsiyasi, ishlatiladigan enzim turi) bo'lishi mumkin. PCR ning muvaffaqiyatiga ta'sir qiluvchi bir necha asosiy omillar quyidagilardan iborat.
01 toza laboratoriya shartlari
PCR bitta molekula DNKni aniqlay olishi uchun laboratoriyada noaniq sharoitlarni saqlab qolish muhimdir. Har doim yangi qo'lqop kiyishingiz, steril shisha idishlar, naychalar va pipet uchlari va steril yechimlardan foydalaning va ish joyini ishga tushirishdan oldin tozalang.
Natijalarning chindan ham to'g'ri namunani kuchaytirishiga erishish uchun har doim DNK va fermentsiz shablon holda nazorat reaktsiyalarini qo'shing.
Aksariyat odamlar o'zlarining muammolarini bartaraf qilish uchun birgalikda foydalanilmagan echimlar to'plamiga ega ekanligiga ishonch hosil qilishadi, chunki ular ko'pincha faqat PCR uchun ajratiladi. DNase va RNase-free PCR-naychalari, aerosolga chidamli pufet uchlari va UV-nurli dudbo'roni bilan ishlaydigan muammolar ham muammolarni kamaytirish yo'llari.
02 Kimyoviy komponentlar
- 18 dan 24 tagacha asoslar mavjud
- Ikkilamchi tuzilishga ega bo'lmagansiz (masalan, shkaflar)
- G / S va A / T juftlarini muvozanatli taqsimlang
- 3-futli uchlarda bir-birlarini qo'shimcha qilmaydi
- Eritma harorati (Tm) taxminan 5-10 daraja Celcius ning tavlama temperatura ostida, odatda 55-65 daraja Celcius
Har ikkala primer uchun Tm ham yaxshi natijalarga erishish uchun o'xshash bo'lishi kerak.
03 Reaksiya aralashmasi: shablon va primerlar
Optimal primer konsentrasiyalari 0,1 dan 0,6 mikromol / L orasida. Shablon miqdori DNKning (inson, bakterial, plazmid) turiga qarab o'zgaradi.
Juda kam miqdordagi shablon yordamida natijalarni yaxshilash bo'yicha boshqa strategiyalar mavjud, masalan, orttirilgan tsikl raqamlari yoki "boshlanish". Har doim yangi primerlarni musbat nazorat reaktsiyasi bilan tekshirib ko'ring, ular sizning maxsus eksperimental sharoitlaringizda ishlaydilar.
04 Reaksiya aralashmasi: ferment faolligi
Reaktsiya aralashmasida MgCl2 kontsentratsiyasi PCR natijasiga ta'sir qilishi mumkin va yanada qattiqroq reaktsiyalarda muhim rol o'ynashi mumkin. Magnezium katyoni polimeraza fermentini aniqlovchi substrat ishlab chiqarish uchun dNTP bilan eriydigan komplekslarni hosil qiladi.
To'rt dNTPning teng miqdori ham polimeraza xato darajasini kamaytirishga yordam beradi. Beta, BSA, yuvish vositasi, DMSO, glitserin va pirofosfataza kabi muayyan hissa moddalari ferment xususiyatiga yoki reaktsiya samaradorligiga ta'sir qilishi mumkin.
05 Thermocycler turi
Laboratoriya asbob-uskunalari uchun xarid qilayotganda, ba'zi termosiklonlar aniq, kerakli haroratni saqlashda boshqalardan ko'ra aniqroq ekanligini unutmang.
Bu arzonroq bo'lgan soha uzoq muddatda siz qattiq reaktsiyaga duch kelganingizda yoki tor interyera haroratini talab qiladigan primerlardan foydalanganingizda to'lamaydi.
Foydalanadigan thermocyclerning aniq markasiga mos keladigan ingichka devorli reaksiya naychalari reaktsiya temperaturalarini optimallashtirishga yordam beradi.
06 O'tkazish sozlamalari
Artırılmış rentabellik, har bir 20 davrda kengayish vaqtini ko'paytirish, kamroq enzimni ko'proq shablonni kuchaytirish uchun qoplash uchun erishiladi. Odatda, kamida 40 tsikl etidyum bromidli bo'yalgan agaroz jel ustida ko'rish uchun etarlicha katta konsentratsiyaga 10 shablondan kam molekulani kuchaytirish uchun etarli.