Zarur oqsil darajasining darajasi, oqsilning mo'ljallangan maqsadidan foydalanishga bog'liq.
Ba'zi ilovalar uchun xom ekstraktsiya etarli. Shu bilan birga, oziq-ovqat va farmatsevtika kabi boshqa vositalar uchun yuqori darajadagi poklik talab etiladi. Bunga erishish uchun ko'plab oqsillarni tozalash usullari odatda bir qator tozalash bosqichlarida qo'llaniladi.
Har bir proteinni tozalash bosqichi, ko'pincha mahsulot halokatiga olib keladi. Shuning uchun, ideal oqsilni tozalash strategiyasi eng yuqori bosqichda eng kam bosqichlarda eng yuqori darajaga yetganidan biri hisoblanadi. Qaysi qadamlardan foydalanishni tanlash maqsadli oqsilning kattaligi, zaryadlanishi, eruvchanligi va boshqa xususiyatlariga bog'liq. Quyidagi usullar bitta sitosolik oqsilni tozalash uchun eng mos keladi. Sitozolik oqsil komplekslarini tozalash yanada murakkab va odatda turli usullarni qo'llashni talab qiladi.
Proteinlarni tozalashning dastlabki bosqichlari
Hujayra ichidagi ( hujayra ichidagi ) oqsillarni tozalashning dastlabki bosqichi xom ekstraktning tayyorlashidir .
Ekstrakte hujayra sitoplazmasındaki barcha oqsillarni murakkab aralashmasi va ba'zi bir qo'shimcha makromoleküller, kofaktörler va ozuqa moddalarni o'z ichiga oladi. Xom ekstraksiya biotexnologiyaning ayrim ilovalari uchun ishlatilishi mumkin, ammo tozalik muammosi bo'lsa, keyinchalik tozalash bosqichlarini bajarish kerak.
Xom protein ekstraktlari kimyoviy va fermentlar , sonikatsiya yoki frantsuz matbuotidan olingan hujayra lizizasi natijasida hosil bo'lgan uyali yong'oqni olib tashlash orqali tayyorlanadi. Qoldiqlar santrifüj bilan chiqariladi va supernatant tuzaladi. Hujayra hujayralari bo'lmagan oqsillarning xom preparatlari santrifüj bilan oddiygina hujayralarni olib tashlash yo'li bilan olinishi mumkin.
Ba'zi biotexnologiya qo'llanmalari uchun termostable fermentlarga bo'lgan talab mavjud: yuqori temperaturani denatürsüz va yuqori darajada o'ziga xos bir faoliyatni muhofaza qiladigan fermentlar. Ularni ishlab chiqaruvchi organizmlar ba'zan ekstremal deb ataladi. Issiqlikka chidamli oqsilni tozalashning oson usuli aralashmaning boshqa oqsillarini isitish orqali denatatsiya qilish, so'ngra eritmani sovutish (agar kerak bo'lsa, termostat fermentini isloh qilish yoki qayta chiqarish uchun ruxsat berish kerak), keyin esa kontsentratsiyali oqsillarni santrifüj bilan chiqarib olish mumkin.
O'rtacha tozalash bosqichlari
O'tmishda xom ekstraksiyadan oqsilni tozalash uchun umumiy ikkinchi qadam baland osmotik quvvatga (ya'ni tuz eritmalariga) ega bo'lgan eritmani tashkil qiladi. Xom ekstraktdagi nuklein kislotalar streptomitsin sulfat yoki protamin sulfat bilan hosil bo'lgan agregatlarni tortib olib tashlash mumkin.
Protein yog'inlari odatda ammoniy sulfat yordamida tuzlanadi.
Turli xil oqsillar ammiak sulfatining turli kontsentratsiyalarida hosil bo'ladi. Umuman olganda, yuqori molekulyar og'irlikdagi oqsillar ammoniy sulfatning quyi konsentratsiyalarida cho'kadi. Tuzli yomg'ir odatda yuqori darajada tozalangan proteinga olib kelmaydi, lekin aralashmaning ba'zi kiruvchi oqsillarini yo'qotish va namunani konsentratlashda yordam berishi mumkin. Eritma tuzlar keyinchalik gözenekli tsellyuloza quvurlari, filtrasyon yoki jel tashqari ajratish kromatografisi bilan diyalizle chiqariladi.
Zamonaviy biotexnologik protokollar odatda standart protseduralarga tayyor echimlarni taqdim etadigan ko'plab savdo-sotiq majmualaridan foydalanadi. Proteinlarni tozalash ko'pincha filtrlar va tayyorlangan jel filtrlash ustunlari yordamida amalga oshiriladi. Barcha qilishingiz kerak bo'lgan ko'rsatmalarga rioya qiling va to'g'ri echimning to'g'ri hajmini qo'shing va eluvanni to'plashda (ustunning boshqa uchi chiqadigan narsa) yangi sinov naychasida belgilangan vaqtni kuting.
- Kromatografik usullarni dastgoh ustunlari yoki avtomatik HPLC uskunalari yordamida qo'llash mumkin. HPLC bilan ajratish jarayoni teskari o'zgarishlar, ion almashinuvi yoki o'lchamlarni ajratish usullari va diode array yoki lazer texnologiyalari yordamida aniqlangan namunalar bilan amalga oshirilishi mumkin. مور
Proteinni ko'rish va tozalashni baholash
- Teskari fosfat kromatografiyasi (RPC) ularning nisbiy hidrofobikligiga asoslangan oqsillarni ajratadi. Bu usul juda tanlangan, ammo organik erituvchilardan foydalanishni talab qiladi. Ba'zi oqsillar hal qiluvchi tomonidan doimiy ravishda denatüre qilinadi va RPC davomida funktsiyani yo'qotadi. Shuning uchun bu usul barcha ilovalar uchun tavsiya etilmaydi, ayniqsa, agar maqsadli oqsilni faolligini saqlab qolish zarur bo'lsa.
- Ion almashinuvi kromatografiyasi zaryadga asoslangan oqsillarni ajralib turishni anglatadi. Kolonlar anion almashinuvi yoki katyan almashinuvi uchun tayyorlanishi mumkin. Anion almashinuvi ustunlari salbiy zaryadlangan oqsillarni jalb qiluvchi statsionar fazani o'z ichiga oladi. Kation almashinuvi ustunlari musbat zaryadlangan oqsillarni jalb qiluvchi teskari va salbiy zaryadlangan boncuklardır. Maqsadli protein (lar) ning elüsyonu, ustun ichidagi pH qiymatining o'zgarishi bilan amalga oshiriladi va bu har bir proteinning zaryadlangan funktsional guruhlarini o'zgartirish yoki neytrallashga olib keladi.
- Hajmi-chiqarib tashlash kromatografiyasi ( jel filtrlash ) kichik molekulalardan katta oqsillarni ajratadi, chunki katta molekulalar xromatografiya kolonida o'zaro bog'liq polimer orqali tezroq harakatlanadi. Katta oqsillar polimerning bo'shliqlariga mos kelmaydi, kichik oqsillar esa kromatografiya kolonasidan o'tib ketish uchun ko'proq vaqt sarflaydi. Eluate elüsyon muddati asosida proteinlarni ajratib turadigan bir qator quvurlar to'planadi. Jel filtrlash, maqsad oqsil dastlab kolonga qo'shilganidan ko'ra kichikroq elüsyon hajmida to'planganligi uchun bir protein namunasini konsentratsiyalash uchun foydali vositadir. Shu kabi filtrlash texnikasi katta miqyosdagi protein ishlab chiqarishda ularning iqtisodiy samaradorligi tufayli ishlatilishi mumkin.
- Affinity kromatografiyasi "oqlash" yoki oqsilni tozalash jarayonini yakunlash uchun juda foydali texnikadir. Xromatografiya ustunidagi boncuklar, maqsadli oqsilga bog'laydigan ligandlar bilan o'zaro bog'liqdir. Keyinchalik, protein, erkin ligantlar o'z ichiga olgan eritma bilan yuvilib, kolondan chiqariladi. Bu usul boshqa usullarga nisbatan eng aniq natijalar va eng aniq faoliyatni beradi.
- SDS-PAGE poliakrilamid jel elektroforez bo'lib, ular SDS (natriy dodesil sulfat) ishtirokida amalga oshiriladi va u ularga katta aniq salbiy zaryad beruvchi oqsillarni bog'laydi. Barcha oqsillarni ayblashlari teng darajada teng bo'lgani uchun, bu usul ularni deyarli to'la hajmiga qarab ajratib turadi. SDS-PAGE ko'pincha ketma-ketlikdagi har bir qadamdan keyin oqsilni tozaligini tekshirish uchun ishlatiladi. Kerakli oqsillar aralashdan asta-sekin olib tashlanganligi sababli, kerakli oqsilni ifodalovchi bitta bant mavjud bo'lgunga qadar, SDS-PAGE jelida tasvirlangan bantlar soni kamayadi.
- İmmünoblotting , afinite kromatografisi bilan birgalikda qo'llaniladigan protein vizualizasyon texnikasi. Muayyan protein uchun antikorlar bir afinite kromatografiyasi ustunida ligandlar sifatida ishlatiladi. Maqsad protein kolonda saqlanadi, keyin ustunni tuz eritmasi yoki boshqa moddalar bilan yuvish yo'li bilan chiqariladi. Radioaktiv yoki bo'yoq belgilariga aloqador antikorlar, aralashmaning qolgan qismidan ajratilgach, maqsadli oqsilni aniqlashda yordam beradi.
Manbalar:
Zubay G. 1988. Biokimyo, 2-nashr. Macmillan Publishing Co., Nyu-York, NY, AQSh.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999 yil. Proteinni tozalash uchun qo'llanma, Chop AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc., Nyu-Jersi, AQSh. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.