DNKning tartiblashi, shuningdek, jel elektroforezidan foydalanib, bir tayanch jufti sifatida ozgina farq qiladigan DNKning iplarini ajratish qobiliyatiga bog'liq.
DNK navbati
1970 yillarning oxirlarida uzoq DNK molekulalari uchun ikkita DNK ketma-ketligi texnikasi ixtiro qilindi. Ular Sanger (yoki dideoxy) usuli va Maxam-Gilbert (kimyoviy ajralish) usuli. Maxam-Gilbert usuli kimyoviy moddalar tomonidan nukleotidlarga xos ajralishga asoslangan va u eng yaxshi oligonükleotidlar (qisqa nukleotit polimerlar, odatda uzunligi 50 ta asosiy juftlikdan kichik) uchun ishlatiladi. Sanger uslubi yanada keng qo'llaniladi, chunki u texnik jihatdan osonroq tasdiqlangan va PCR paydo bo'lishi va texnikaning avtomatlashuvi bilan bir qatorda butun genlarni o'z ichiga olgan uzoq umr DNKlarga osonlikcha qo'llaniladi. Ushbu texnik PCR uzayishi reaksiyalari davomida dideoksinükleotidlar tomonidan zanjirni bekor qilishga asoslangan.
Sanger usuli
Sanger uslubida tahlil qilinishi kerak bo'lgan DNK strandasi shablon sifatida ishlatiladi va DNK polimerazi, PCR reaktsiyasida primerlardan foydalangan holda bepul iplarni ishlab chiqarish uchun ishlatiladi.
To'rt nükleotidlerden biri (ATP, CTP, GTP yoki TTP) uchun dideoksinükleosid trifosfat (ddNTP) analoglarının ma'lum bir foizini o'z ichiga olgan to'rt xil PCR reaksiya aralashmasi tayyorlanadi. Yangi DNK iplari sintezi ushbu analoglardan biriga qo'shilmaguncha davom etaveradi, shu vaqtning o'zida ipni erta qisqartiradi.
Har bir PCR reaktsiyasi turli xil uzunlikdagi DNK iplari aralashmasini o'z ichiga oladi, ularning barchasi bu reaksiya uchun dideoksi bo'lgan nukleotid bilan yakunlanadi. Jel elektroforez keyinchalik to'rtta reaksiyaning iplarini to'rtta alohida chiziq bilan ajratish uchun ishlatiladi va naqlli nukleotid bilan qanday uzunlikdagi iplar soniga asoslangan asl shablonning tartibini belgilaydi.
Avtomatlashtirilgan Sanger reaktsiyasida to'rt xil rangli floresan teg bilan etiketlenmiş primerler ishlatiladi. PCR reaktsiyalari, turli dideoksi nükleotidlerin borlig'ida, yuqorida ta'rif etilganidek, amalga oshiriladi. Keyinchalik, keyinchalik to'rt reaksiya aralashmasi birlashtiriladi va bir jel tolasiga qo'llaniladi. Har bir qismning rangi lazer nuri yordamida aniqlanadi va ma'lumotlar har bir rang uchun tepadan ko'rinadigan kromatogramlarni ishlab chiqaruvchi kompyuter tomonidan to'planadi, shundan so'ng shablon DNKning ketma-ketligi aniqlanishi mumkin.
Odatda, avtomatik tartiblash usuli faqat taxminan 700-800 tagacha tayanch juftligiga qadar ketma-ketlik uchun aniqdir. Shu bilan birga, primer yurish va pushti sequencing kabi qadamli usullarni qo'llash orqali katta genlarni va, aslida, butun genlarni to'liq sekanslarini olish mumkin.
Primer Walkingda , katta genning ishlaydigan qismi Sanger usuli yordamida ketma-ketliklanadi. Yangi primerlar ketma-ketlikning ishonchli qismidan hosil bo'ladi va asl reaktsiyalar oralig'idan tashqarida bo'lmagan genning qismini tartibga solish uchun ishlatiladi.
Shotgun sequencing , qiziqishning DNK qismini tasodifiy kesib olib tashlashni talab qiladi, bu esa mos keladigan (boshqariladigan) o'lchovli bo'laklarga bo'linadi, har bir qismini tartibga keltiradi va bir-biriga o'xshash ketma-ketliklar asosida parchalarni tashkil qiladi. Ushbu texnikani echib bo'lmaydigan qismlarni joylashtirish uchun kompyuter dasturlarini qo'llash osonlashdi.